International Journal of Reproductive BioMedicine

en ارزیابی غیرتهاجمی جنین با استفاده از آزمایش‌های ژنتیکی مبتنی بر cfDNA و متابولومیکس اسید آمینه در ارتباط با مورفولوژی جنین انسان: یک مطالعه مورد-شاهدی Non-invasive embryo assessment: Cell-free DNA-based genetic testing and amino acid metabolomics in relation to morphology: A case-control study Reproductive Genetics Original Article Original Article <div style="text-align: justify;">مقدمه: DNA آزاد سلولی (cfDNA) موجود در محیط کشت جنین (SCM) گزینه‌ای غیرتهاجمی برای تست ژنتیکی پیش از لانه‌گزینی است؛ با این حال، غلظت پایین و تکه‌تکه‌شدن این DNA، قابلیت اطمینان بالینی را محدود می‌سازد. تلفیق ارزیابی ژنتیکی با پروفایل متابولومیک می‌تواند اطلاعات مکملی را در مورد توانمندی رشدی جنین فراهم کند. هدف: در این مطالعه هدف بهینه‌سازی استفاده از cfDNA در محیط کشت بلاستوسیست با استفاده از روش‌های پیش‌ آماده‌سازی و همچنین پروفایل اسید آمینه به عنوان یک شاخص مکمل برای تشخیص سلامت جنین بوده است. مواد و روشها: در این مطالعه مورد-شاهدی (1401-1399) 90 جنین با روش هیبریداسیون فلورسنس در جا (FISH) و یا هیبریداسیون مقایسه‌ای ژنومی (array CGH) شناسایی و بررسی شدند. محیط کشت‌ جنین‌های منتخب به 3 گروه (30 = n) پیش تکثیر شامل: جوشاندن سریع، خالص‌سازی مبتنی بر سیلیکا و تکثیر کل ژنوم (WGA) تقسیم شد. تعیین جنسیت با روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی (qPCR) انجام شد. برای کنترل کیفی cfDNA و غربالگری آنیوپلوئیدی، از کیت multiplex IRFiling و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز فلورسنت کمی (QF-PCR) استفاده گردید. پروفایل آمینواسیدی در مراحل مختلف رشد جنینی و درجات کیفی متفاوت، از طریق کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی (LC-MS/MS) کمی‌سازی شد. نتایج: جوشاندن سریع منجر به شکست کامل در تقویت DNA شد. در مقابل، خالص‌سازی مبتنی بر سیلیکا، تطابق 70% برای تعیین جنسیت با qPCR و 7/%56 برای QF-PCR نشان داد. روش WGA به بالاترین کارایی دست یافت (3/73% برای qPCR و 7/56% برای QF-PCR)، اگرچه بررسی‌های کنترل کیفیت، مواردی از طبقه‌بندی اشتباه را گزارش کرد. در مورد پروفایل اسید آمینه با استفاده از LC-MS/MS آلانین و آرژنین به‌طور معناداری سطوح بالاتر را در جنین‌های تری‌پرونوکلئار (3PN) نشان داد. علاوه بر این، در بلاستوسیست‌های باکیفیت سطوح بالاتری از اسید گلوتامیک همراه با کاهش کلی آمینواسیدهای خارج‌ سلولی در مقایسه با جنین‌های باکیفیت پایین و گروه‌های کنترل نمایان بود. نتیجهگیری: روش WGA در مقایسه با دو روش دیگر، توانست، شناسایی و تشخیص cfDNA را در محیط کشت جنین بهبود بخشد؛ اما با شرایط بررسی حاضر برای niPGT بالینی به تنهایی کافی نیست و نیاز به توسعه و بهبود شرایط دارد. در مورد پروفایل اسیدآمینه نیز این روش میتواند به عنوان مکمل برای نشان دادن وضعیت کروموزومی و پتانسیل رشد جنین در یک استراتژی چند وجهی برای ارزیابی غیرتهاجمی جنین در PGT به کارگرفته شود.</div> Background: Cell-free DNA (cfDNA) in spent culture medium (SCM) offers a non-invasive option for preimplantation genetic testing, but its low concentration and fragmentation reduce clinical reliability. Combining genetic assessment with metabolomic profiling may provide complementary information about embryo competence. Objective: This study assessed pre-analytical cfDNA processing workflows and examined whether SCM amino acid metabolic patterns could act as practical markers of embryo quality. Materials and Methods: In this case-control study (2021-2023), 90 embryos were evaluated using fluorescence in situ hybridization or array comparative genomic hybridization. SCM samples underwent rapid boiling, silica-based purification, or whole-genome amplification (WGA). Sex determination was performed using quantitative polymerase chain reaction (qPCR). For cfDNA quality control and aneuploidy screening, the multiplex IRFiling kit and quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) were used. Amino acid profiles across embryonic developmental stages and quality grades were quantified via liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Results: Rapid boiling resulted in complete failure of DNA amplification. Conversely, silica-based purification yielded 70.0% concordance for qPCR-based sexing and 56.7% for QF-PCR. WGA achieved the highest efficacy (73.3% qPCR and 56.7% QF-PCR concordance), although quality control checks flagged occasional misclassifications. LC-MS/MS profiling revealed significantly elevated alanine and arginine levels in tripronuclear embryos. Furthermore, high-quality blastocysts exhibited elevated glutamic acid levels alongside a pronounced overall depletion of extracellular amino acids compared to low-quality counterparts and controls. Conclusion: WGA improves cfDNA detectability and qPCR accuracy compared with boiling or purification, but remains inadequate as a standalone screening approach. SCM amino acid profiling provides informative, complementary metabolic signatures of developmental competence, supporting a multimodal strategy for non-invasive embryo assessment. DNA آزاد سلولی, تست ژنتیکی پیش از لانه‌گزینی, تکنیک‌های کشت جنین, متابولیسم آمینواسیدها, بلاستوسیست. Cell-free nucleic acids, Noninvasive prenatal testing, Embryo culture techniques, Amino acid metabolism, Blastocyst. 0 0 http://ijrm.ir/browse.php?a_code=A-10-1088-7&slc_lang=en&sid=1 Maliheh Jahanara malihejahanara@gmail.com 0009-0000-7532-8623 No Department of Biotechnology, School of Veterinary Medicine, Shiraz University, Shiraz, Iran. Hassan Sharifiyazdi Sharifiy@shirazu.ac.ir 0000-0002-1243-5744 No Department of Clinical Sciences, School of Veterinary Medicine, Shiraz University, Shiraz, Iran. Seyed Mehdi Kalantar SMKYZD@gmail.com 0000-0002-6994-6449 No Abortion Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoghi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. Nasrin Ghasemi nghasemi479@gmail.com 0000-0002-1103-6004 No Abortion Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoghi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. Mojgan Moshrefi mojganmoshrefi@gmail.com 0000-0002-6306-7881 No Biotechnology Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. Mehran Ghaemi mghaemi100@gmail.com 0000-0002-4606-8161 No Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran. Fateme Montazeri f.montazeri@ssu.ac.ir 0000-0002-1984-951x Yes Abortion Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoghi University of Medical Sciences, Yazd, Iran.