International Journal of Reproductive BioMedicine

en دودمانه سلولی تغییر ژنتیکی یافته فیبروبلاست پوست ختنه‌گاه انسان (YhFF#8) با بیان پایدار ژن Cas9: یک گزارش منبع آزمایشگاهی The genetically modified human foreskin fibroblast cell line (YhFF#8) stably expressing Cas9 gene: A lab resource report Stem Cell & Cloning Original Article Original Article <div style="text-align: justify;">مقدمه: ردههای سلولی بیانکننده پایدار  Cas9(پروتئین 9 مرتبط با CRISPR) به عنوان ابزار ارزشمندی در تحقیقات ژنتیکی پدیدار شدهاند که کارایی سیستم CRISPR/Cas9 را افزایش داده و روشهای ویرایش ژن را ساده میکنند. این دودمانهای سلولی امکان ویرایش همزمان چندین ژن را فراهم کرده و زمان کلی ویرایش را کاهش میدهد. هدف: این مطالعه با هدف ایجاد یک رده سلولی فیبروبلاست انسانی پایدار با قابلیت تبدیل ژنتیکی به شکل جهش یافته، به عنوان یک مدل سلولی برای یک بیماری ژنتیکی خاص انجام شد. خط سلولی ایجاد شده بررسی مکانیسمهای بیماری، آزمایش درمانهای بالقوه، و به دست آوردن بینش در مورد فرآیندهای مولکولی اساسی را تسهیل میکند. مواد و روش‌ها: سلول‌های 293LTV کلیه جنینی انسان (HEK293LTV) برای تولید ذرات شبهویروس مورد استفاده قرار گرفتند و سلول‌های فیبروبلاست پوست ختنه‌گاه انسان یزد از سلول‌های دسته 8 (YhFF#8) برای تغییرات ژنتیکی هدف قرار گرفتند. ترانزفکشن سلول‌های HEK293LTV با DNA پلاسمیدی نوترکیب pCDH-Cas9 باعث تولید ذرات شبهویروسی شد. سلول‌های YhFF#8 ترانزداکت شده با استفاده از آنتی‌بیوتیک پورومایسین تحت انتخاب قرار گرفتند. درخشش پروتئین فلورسنت سبز (GFP) در سلولهای ترانزداکت شده قبل و بعد از انتخاب آنتیبیوتیکی سلولها تصویربرداری شد. در ضمن سطح بیان نسبی ژن Cas9 در مقایسه با ژنهای GFP و GAPDH با روش کمی (qPCR) تعیین گردید. یافته‌ها: این مطالعه صحت توالی کاست ژن Cas9 و فعالیت رونویسی آن را تأیید کرد. سلول‌های YhFF#8 ترانزداکت شده، فلورسانس سبز نشان داده و با انتخاب آنتی‌بیوتیکی که منجر به خالصسازی تقریباً 100% سلول‌های تبدیل شده شد. بیان ژن GFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس، امکان رصد زنده سلول‌های YhFF#8-Cas9-GFP-PuroR را در محیط کشت را فراهم کرد. نتیجه‌گیری: سلول‌های YhFF#8-Cas9-GFP-PuroR، برچسب‌گذاری‌شده و مستعد برای انجام فرایند ویرایش ژنومی، منبع بهینه‌ای برای تولید رده‌های سلول‌های بنیادی پرتوان القایی برای تحقیقات زیست‌پزشکی آینده فراهم می‌کنند.</div> <div style="text-align: justify;">Background: Stable Cas9 (CRISPR-associated protein 9)-expressing cell lines have emerged as valuable tools in genetic research, enhancing the efficiency of the CRISPR/Cas9 system and streamlining gene editing procedures. These cell lines enable simultaneous editing of multiple genes and reduce the overall editing time. Objective: This study aimed to develop a stable human fibroblast cell line capable of genetic conversion into a mutant form, serving as a cellular model for a specific genetic disease. The established cell line facilitates investigation of disease mechanisms, testing of potential treatments, and gaining insights into underlying molecular processes. Materials and Methods: Human embryonic kidney 293LTV cells were used to produce pseudo-virus particles, while Yazd human foreskin fibroblasts batch 8 (YhFF#8) cells were targeted for genetic modification. Transfection of human embryonic kidney 293LTV cells with pCDH-Cas9 plasmid DNA generated pseudo-viral particles. YhFF#8 cells were transduced and selected using antibiotics. Green fluorescent protein (GFP) detection confirmed successful transduction and selection. Relative expression levels of the Cas9 gene were determined by quantitative polymerase chain reaction. Results: The study validated the fidelity of the Cas9 gene cassette sequence and its transcriptional activity. Transduced YhFF#8 cells exhibited green fluorescence, with antibiotic selection resulting in nearly 100% transduced cells. A reporter GFP gene enabled real-time monitoring of YhFF#8-Cas9-GFP-PuroR cells using fluorescence microscopy. Conclusion: YhFF#8-Cas9-GFP-PuroR cells, labeled and susceptible to genomic editing, provide an optimal source for generating induced pluripotent stem cell lines for future biomedical research.</div> فیبروبلاست ها, دودمانه سلولی, ترانزداکشن ژنتیکی, کریسپر-کاس 9. Fibroblasts, Cell line, Genetic transduction, CRISPR-Cas9. 61 68 http://ijrm.ir/browse.php?a_code=A-10-502-1&slc_lang=en&sid=1 Farzad Soheilipour soheilipourfarzad@gmail.com 0000-0002-8391-3678 No Stem Cell Biology Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Gonbad Kavous University, Gonbad Kavous, Iran. Sohrab Boozarpour so.boozarpour@gmail.com 0000-0003-0873-7499 No Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Gonbad Kavous University, Gonbad Kavous, Iran. Shiva Aghaei aghaei.shiva@gmail.com 0000-0002-7817-6263 No Stem Cell Biology Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. Ehsan Farashahi Yazd ehsanfarashahi@ssu.ac.ir 0000-0003-1122-0626 Yes Stem Cell Biology Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran.