en تکثیر سلولهای بنیادی زاینده انسانی در کشت دراز مدت Original Article Original Article <strong><span style="font-family:b mitra;">مقدمه</span></strong><span style="font-family:b mitra;">: سلول&shy;های بنیادی اسپرماتوگونی بخشی از جمعیت سلول&shy;های اسپرماتوگونی تمایز نیافته نوع </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">A</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> هستند که آغاز کننده پروسه پیچیده اسپرماتوژنز می&shy;باشند. مطالعات مختلفی در زمینه کشت این سلول&shy;ها در محیط </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">in vitro</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> تاکنون انجام نشده است. اما مطالعات موجود در مورد اسپرماتوگونی&shy;های انسانی محدود &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;می&shy;باشد. هدف از کشت این سلول&shy;ها و ازدیاد آن&shy;ها در محیط کشت، پیوند این سلول&shy;ها جهت درمان ناباروری در بیماران مبتلا به سرطان پس پایان پروسه درمان است.</span><span dir="LTR"></span><br> <strong><span style="font-family:b mitra;">هدف:</span></strong> <span style="font-family:b mitra;">در این مطالعه، کشت سلول&shy;های بنیادی اسپرماتوگونی انسانی در محیط کشت به مدت شش هفته و شناسایی سلول&shy;های بنیادی اسپرماتوگونی در محیط کشت با استفاده ار مارکرهای اختصاصی این سلول&shy;ها شامل </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Oct4</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> و </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PLZF</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> انجام شد.</span><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"></span></span><br> <strong><span style="font-family:b mitra;">مواد و روش&shy;ها:</span></strong><span style="font-family:b mitra;"> بافت بیضه انسانی گرفته شده از بیمار مرگ مغزی، با استفاده از هضم آنزیمی بوسیله کلاژناز تیپ 4 و تریپسین هضم گردید. سلول&shy;های جدا شده با استفاده از محیط کشت </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">StemPro34</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> غنی شده با مواد لازم جهت کشت سلول&shy;های اسپرماتوگونی و فاکتورهای رشد از جمله </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">GDNF</span></span></span><span style="font-family:b mitra;">، </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">bFGF</span></span></span><span style="font-family:b mitra;">، </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">EGF</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> و </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">LIF</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> جهت کمک به تقسیمات خودنوزایی سلول&shy;های بنیادی اسپرماتوگونی کشت داده شدند. مطالعات ایمونوهیستوشیمی برای تشخیص مارکر </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Oct4</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> در بافت بیضه و سلول&shy;های اسپرماتوگونی در طول کشت انجام گردید. همینطور از واکنشهای زنجیره&shy;ای پلی&shy;مراز معکوس برای ژن </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PLZF</span></span></span> <span style="font-family:b mitra;">جهت اثبات سلول&shy;های اسپرماتوگونی در بافت و در طول کشت استفاده شد.</span><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:14.0pt;"></span></span><br> <strong><span style="font-family:b mitra;">نتایج:</span></strong><span style="font-family:b mitra;"> سلول&shy;های بنیادی زاینده بافت بیضه انسانی، پس از کشت و تکثیر به مدت 6 هفته در محیط کشت همراه با فاکتورهای رشد اختصاصی، توسط مارکرهای اختصاصی این سلول&shy;های بنیادی شامل </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Oct4</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> و </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PLZF</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"> شناسایی شدند. </span><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:14.0pt;"></span></span><br> <strong><span style="font-family:b mitra;">نتیجه&shy;گیری:</span></strong><span style="font-family:b mitra;"> سلول&shy;های بنیادی اسپرماتوگونی انسانی قادرند در محیط کشت با استفاده از فاکتورهای تغذیه&shy;ای مخصوص رشد این سلول&shy;ها بدون تمایز رشد کرده و با تقسیمات خود نوزایی زیاد شوند. این سلول&shy;ها مارکرهای اختصاصی خود را در طول کشت دراز مدت مطابق با بافت بیضه بیان می&shy;کنند.</span><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:14.0pt;"></span></span> <strong>Background:</strong> Spermatogonial stem cells (SSCs), a subset of undifferentiated type A spermatogonia, are the foundation of complex process of spermatogenesis and could be propagated in vitro culture conditions for long time for germ cell transplantation and fertility preservation.<br> <strong>Objective:</strong> The aim of this study was in vitro propagation of human spermatogonial stem cells (SSCs) and improvement of presence of human Germ Stem Cells (hGSCs) were assessed by specific markers POU domain, class 5, transcription factor 1 (POU5F1), also known as Octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4) and PLZF (Promyelocytic leukaemia zinc finger protein).<br> <strong>Materials and Methods:</strong> Human testicular cells were isolated by enzymatic digestion (Collagenase IV and Trypsin). Germ cells were cultured in Stem-Pro 34 media supplemented by growth factors such as glial cell line-derived neurotrophic factor, basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor and leukemia inhibitory factor to support self-renewal divisions. Germline stem cell clusters were passaged and expanded every week. Immunofluorecent study was accomplished by Anti-Oct4 antibody through the culture. The spermatogonial stem cells genes expression, PLZF, was studied in testis tissue and germ stem cells entire the culture.<br> <strong>Results:</strong> hGSCs clusters from a brain dead patient developed in testicular cell culture and then cultured and propagated up to 6 weeks. During the culture Oct4 were a specific marker for identification of hGSCs in testis tissue. Expression of PLZF was applied on RNA level in germ stem cells.<br> <strong>Conclusion: </strong>hGSCs indicated by SSCs specific marker can be cultured and propagated for long-term in vitro conditions. سلولهای بنیادی زاینده انسانی, کشت طولانی مدت, PLZF, Oct4. Human germ stem cells, Human Spermatogonial stem cells, SFM, GDNF, LIF, OCT-4, PLZF. 551 0 http://ijrm.ir/browse.php?a_code=A-10-1-496&slc_lang=en&sid=1 Mohammad Mehdi Akhondi محمد مهدی آخوندی No Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran پژوهشکده بیوتکنولوژی تولیدمثل، پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی ابن سینا، تهران، ایران Arash Mohazzab آرش مهذب No Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran پژوهشکده بیوتکنولوژی تولیدمثل، پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی ابن سینا، تهران، ایران Mahmood Jeddi-Tehrani محمود جدی تهرانی No Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran پژوهشکده آنتی بادی مونوکلونال، پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی ابن سینا، تهران، ایران Mohammad Reza Sadeghi محمدرضا صادقی No Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran پژوهشکده آنتی بادی مونوکلونال، پژوهشگاه فناوری های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی ابن سینا، تهران، ایران Akram Eidi اکرم عیدی No Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران Abbas Khodadadi عباس خدادادی No Research and Preparation Center, Iranian Tissue Bank, Tehran University of Medical Science, Tehran, Iran مرکز تحقیقات بانک بافت ایران، دانشکده علوم پژشکی تهران، تهران، ایران Zeinab Piravar زینب پیراور saba.piravar@gmail.com Yes Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران